僅供研究使用
TNF-A試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-A濃度的标準品 、未知濃度的樣品加入微孔酶标闆内進行檢測(cè) 。先将TNF-A和生物素标記的抗體同時溫育。洗滌後，加入親和素标記過的HRP。再經過溫育和洗滌 ，去除未結合的酶結合物 ，然後加入底物A、B，和酶結合物同時作用。産(chǎn)生顔色 。顔色的深淺和樣品中TNF-A的濃度呈比例關系。
試劑盒内容及其配制：
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試劑盒成份
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96孔配置
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48孔配置
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96/48人份酶标闆
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1塊闆（96T）
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半塊闆（48T）
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塑料膜闆蓋
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1塊
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半塊
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标準(zhǔn)品:400pg/ml
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1瓶（1.0ml）
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1瓶（0.5ml）
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空白對照
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1瓶（1.0ml）
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1瓶（0.5ml）
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标準品稀釋緩沖液
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1瓶（8.0ml）
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1瓶（4.0ml）
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生物素标記(jì)的抗TNF-A抗體(tǐ)
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1瓶（8.0ml）
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1瓶（4.0ml）
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親和鏈酶素-HRP
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1瓶（12ml）
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1瓶（5ml）
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洗滌緩沖液
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1瓶（20ml）
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1瓶（10ml）
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底物A
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1瓶（6.0ml）
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1瓶（3.0ml）
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底物B
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1瓶（6.0ml）
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1瓶（3.0ml）
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終止液
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1瓶（6.0ml）
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1瓶（3.0ml）
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自備材料：
1. 蒸餾(liú)水 。
2. 加樣(yàng)器 ：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3. 振蕩(dàng)器及磁力攪(jiǎo)拌器等。 1、血清……操作過(guò)程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和内毒素的試管 。收集血液後，1000×g離心10分鍾将血清和紅(hóng)細胞迅速小心地分離。
2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽 、肝素血漿可用於(yú)檢測(cè) 。1000×g離心30分鍾去除顆粒 。
3、 細胞上清液……1000×g離(lí)心10分鍾去除顆(kē)粒和聚合物。
4、 組織勻漿(jiāng)……将組織加入适量生理鹽水搗(dǎo)碎。1000×g離心10分鍾 ，取上清液。
5、 保存……如果樣品不立即使用，應将其分成小部分-70℃保存，避免反複冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並(bìng)確(què)保樣品均勻地充分解凍。 ● 試劑應按标簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢複(fù)到室溫。稀稀過後的标準品應丢棄，不可保存。
● 實(shí)驗中不用的闆條應立即放回包裝袋中 ，密封保存，以免變(biàn)質。
● 不用的其它試劑(jì)應包裝好或蓋(gài)好。不同批号的試劑(jì)不要混用 。保質前使用。
● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶(dài)金屬部分的加樣器。
● 使用幹(gàn)淨的塑料容器配置洗滌(dí)液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品。
● 底物A應揮發，避免長(zhǎng)時間打開蓋子 。底物B對光敏感 ，避免長(zhǎng)時間暴露於(yú)光下。避免用手接觸，有毒 。實驗完成後應立即讀取OD值。
● 加入試劑(jì)的順序應一緻，以保證所有反應闆孔溫育的時間(jiān)一樣。
● 按照說明書中标明的時間(jiān)、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
安全性：
1. 避免直接接觸(chù)終止液和底物A、B，一旦接觸(chù)到這些液體，請盡快用水沖(chōng)洗 。
2. 實(shí)難(nán)中不要吃喝 、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑(jì)盒裏(lǐ)的任何成份。
試劑的準備：
1. 标準品：标準品的系列稀釋應在實驗時準備(bèi) ，不能儲(chǔ)存 。稀釋前将标準品振蕩混勻 。稀釋比例按下表中進行：
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400
pg/ml
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（6号标準品）
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原倍濃(nóng)度不用稀釋(shì)直接加入50ul
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200
pg/ml
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（5号标準品）
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100ul的原倍标準(zhǔn)品加入100ul的标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
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100
pg/ml
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（4号标準品）
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100ul的5号标準(zhǔn)品加入100ul的标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
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50
pg/ml
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（3号标準品）
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100ul的4号标準(zhǔn)品加入100ul的标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
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25
pg/ml
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（2号标準品）
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100ul的3号标準(zhǔn)品加入100ul的标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
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12.5
pg/ml
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（1号标準品）
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100ul的2号标準(zhǔn)品加入100ul的标準(zhǔn)品稀釋(shì)液
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0
pg/ml
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（空白對照）
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原倍濃(nóng)度不用稀釋(shì)直接加入50ul
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2. 洗滌(dí)緩沖(chōng)液（50×）的稀釋 ：蒸餾水50倍稀釋。
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小於(yú)1号标準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值爲0.990。
2. 特異(yì)性：不與其它細(xì)胞因子反應。
3. 重複性：闆内、闆間變(biàn)異系數均小於(yú)10%。 操作步驟： 1. 使用前，将所有試劑(jì)充分混勻。不要使液體産(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡 ，産(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據待測(cè)樣品數量加上标準品的數量決定所需的闆條數。每個标準品和空白孔建議做複(fù)孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用複(fù)孔的盡量做複(fù)孔。
3. 加入稀釋好後的标準品50ul於(yú)反應孔、加入待測(cè)樣品50ul於(yú)反應孔内。立即加入50ul的生物素标記的抗體。蓋上膜闆，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鍾。
4. 甩去孔内液體，每孔加滿洗滌(dí)液 ，振蕩(dàng)30秒 ，甩去洗滌(dí)液 ，用吸水紙拍幹。重複此操作4次。如果用洗闆機洗滌(dí)，洗滌(dí)次數增加一次。
5. 每孔加入100ul的親和鏈(liàn)酶素-HRP，輕輕振蕩(dàng)混勻，37℃溫育30分鍾。
6. 甩去孔内液體，每孔加滿洗滌(dí)液，振蕩(dàng)30秒，甩去洗滌(dí)液，用吸水紙拍幹。重複此操作4次。如果用洗闆機洗滌(dí)，洗滌(dí)次數增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕(qīng)輕(qīng)振蕩(dàng)混勻，37℃溫育5分鍾。避免光照。
8. 取出酶标闆，迅速加入50ul終止液，加入終止液後(hòu)應立即測(cè)定結果。
9. 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結 果 判 斷 與 分 析：
1、 儀器值：於(yú)波長(zhǎng)450nm的酶标儀上讀取各孔的OD值
2、 以吸光度OD值爲縱坐标（Y），相應的TNF-A标準品濃度爲橫(héng)坐标（X），做得相應的曲線，樣品的TNF-A含量可根據其OD值由标準曲線換算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用标準物的濃度與OD值計算出标準曲線的回歸(guī)方程式，将樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即爲樣品的實際濃度。
3、 檢測(cè)值範(fàn)圍 ： 0-400pg/ml
4、 敏感度：1.0pg/ml
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