GIBCO血清培養乳鼠心肌細胞操作說明

                      GIBCO血清培養乳鼠心肌細胞操作說明

材料：乳鼠（1-3d）
試劑：DMEM/F12（gibco），FBS（四季青），0.125%混合酶（胰酶和膠原酶1），GIBCO血清
器材：高壓包1（眼科剪、鑷2套，200目濾網1個），高壓包2（消化用小錐形瓶及轉子和蓋子，9cm平皿1套，100ml燒杯2個），高壓包3（小紗布塊，細胞計數闆），離心管（nunc，15ml，無菌），吸管（一次性單包裝無菌，碧雲天），酒精棉球，75%酒精1瓶，口罩，帽子，手套，mark筆，離心機，超淨台，培養箱，磁力攪拌器（可控溫），水浴鍋
，消化水浴杯（内有300ml雙蒸水），卧式染色缸1套（取心用），自制小支架2個（墊平皿用）。
（值得注意的是我所用的裝培養基的瓶子都是藍色絲口瓶
，這種瓶子瓶口大，相對來說不容易污染。）
步驟：
一、準備
1.  帶口罩、帽子，洗手
，入培養室
2.  酒精棉球擦拭超淨台後，放高壓包123和離心管、吸管、酒精棉球缸於超淨台内；
3.  放75%酒精1卧式染色缸一套（打開蓋）、mark筆於超淨台外，放消化水浴杯於磁力攪拌器上（開機，溫度37度，轉速小於100）在超淨台外；
4.  放15%*培養基和消化酶於水浴鍋内（開機
，溫度37度）
5.  開超淨台和培養室紫外30min。
二、30min後
1.帶手套，洗淨滑石粉
，烘幹後入培養室，關紫外，開超淨台風機，酒精擦手。
2.取4度不*培養基置於超淨台上，取平皿分爲兩個，每個裏面各放一套器械，然後各加不*培養基8ml，取100ml燒杯一個。将100ml燒杯和其中一個平皿放在超淨台外的桌子上，100ml燒杯中倒入75%酒精。
3.拿鑷子夾乳鼠，在燒杯中浸泡5-10秒，然後置於殺鼠台上（就是卧式染色缸的蓋子），剪刀撕開皮膚，開胸（注意不要損傷消化道），除心包
，擠壓後取心，直接取心室肌，置於裝有4度不*培養基的平皿中。以此類推，直至全部取完。
4.隻将有心肌的平皿放回超淨台，酒精擦手。
5.用第2套剪刀先略微剪一下，基本上把每個心髒剪成兩半，目的在於先跑跑血。然後
，小心移入另一個平皿，簡單沖洗後，留下少許液體，猛剪，直到您滿意爲止。然後再用不*培養基洗三遍。用吸管移植消化用錐形瓶
。
6.加入消化酶10ml，水浴杯内消化10-15min，*次棄上清；剩餘組織中再次加入混合酶繼續磁力消化，靜置後将上清液移入含15%FBS的DMEM/F12培養基的離心管終止消化，4℃保存；剩餘組織用同樣方法反複消化，直至消化*。1 200 r/min離心10 min，棄上清，用培養液制成單細胞懸液，接種於25 cm培養瓶
7. 37度、5% CO2培養箱中孵育1.5 h，吸出細胞懸液離心，細胞計數闆計數
，調整細胞濃度爲1-5×106個/ml後接種於培養瓶和鋪有爬片的6孔闆。
8. 24h後觀察，期間不要看細胞。24h即可見同步搏動瞭
。
三、收拾培養室，寫實驗記錄。 

我司代理的胎牛血清品牌有NQBB、Gibco、invitrogen、BD等，血清主要産自於(yú)澳大利亞，血源以封閉的心髒穿刺方式採自8月齡胎牛，産品經3次100nm過濾，在淨化車間過濾包裝。經嚴格檢測確(què)保無支原體，細菌病毒檢測依據美國藥典（USP）和美國聯邦法規第九篇（9CFR），符合檢測标準。