Western免疫印迹常見問題解答之信号弱

Western免疫印迹常見問題解答之信号弱

表現爲在1-30秒曝光後仍然檢測(cè)不到目的條帶，上海恒遠生物爲您列表可能出現的原因及解決辦(bàn)法，歡迎點擊閱讀賞析，如有任何問題均可我司。

原因	解決方法
一抗與膜的孵育時間不夠	磷酸化蛋白抗體是針對於(yú)特定的一個或兩個磷酸化位點的，特異性很高但往往比常規的抗體能得到的信号要弱一些。用合适的緩沖液稀釋，並(bìng)在4°C與膜孵育過一夜 ，對於(yú)磷酸化抗體來說很關鍵。
電(diàn)泳後(hòu)的蛋白沒有全部轉移到膜上	增加轉膜所用的時間或電(diàn)壓。通過預染分子量标準品判斷(duàn)轉膜是否*，不建議用染料染膜來觀察，因爲這樣會抑制化學發光反應 。
膜的封閉時間過長	在牛奶中封閉(bì)時間太長會遮蔽抗原表位並(bìng)會把轉移到膜上的蛋白置換下來。封閉(bì)隻需1小時（決不要過一夜封閉(bì)）。
目的基因的表達量太少，低於(yú)檢測(cè)底限。	每條泳道中上樣總蛋白20 μg通常就足夠瞭(le)。如果目的基因的表達水平較低，則可以增加上樣量。或是在做SDS-PAGE之前先做免疫沉澱。嘗(cháng)試其他細胞系或是高表達該蛋白的組織樣品。
二抗太弱。	換(huàn)用其他批次的二抗或是提高二抗的濃(nóng)度。
LumiGLO?試劑沒有按規定配制或是儲存液試劑A和B已經相互污染。	重新配制LumiGLO?試劑。用抗生物素-HRP和生物素标記的分子量标準品作爲化學發光檢測反應的陽性對照。

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