嚴謹的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系 ，對實驗結果分析是非常有用。特别是當實驗出現問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大小），空白載體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照），已知量标準産物的正對照；另外還有内參 。内參即是内部參照（Internal Control），對於(yú)哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定 ，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。蛋白含量是肯定要測的。首先合适的上樣蛋白，western圖才比較比較美觀 。而且對於(yú)需要半定量的western，那是肯定要測含量後再做western瞭(le)。
1.marker呢，就相當於(yú)一把标尺，用於(yú)驗證你的目的蛋白的分子量，比如你的marker上有30和35kD的蛋白條帶(dài)，而你的目的蛋白是32kD，跑膠以後你如果看到你的目的蛋白條帶(dài)在30和35kD之間，就可以初步斷定是你的目的蛋白 。
2. 内參呢，内參也叫看家基因 ，在組織或細胞中都會表達，且表達量在不同組織或細胞中幾乎是相同的 ，一般有β-ACTIN，GAPDH等。其作用有二，1. 是看提取蛋白質量的好壞。如果做western的時候，内參照蛋白有條帶 ，而目的蛋白沒有 ，說明蛋白的提取和轉膜等步驟沒有問題，是目的蛋白的抗體質量不好或者是稀釋倍數不對。2. 是比較客觀的說明目的蛋白的表達情況，消除上樣量等的誤差。不同的标本之間由於蛋白提取的量有差别，可能強陽性的表達跑出來的帶很弱。因此設立内參照 ，比較不同标本之間的表達情況。
3. 測一下蛋白濃度再上樣，這樣好點。當然也看你的實驗室是定性還是定量瞭(le) ，定性的話，我覺得可以不用測濃度；要是準備(bèi)定量，還是盡量保證上樣量一緻吧。
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