免疫熒光技術有兩種檢測(cè)方法 ：用熒光标記抗體示蹤或檢測(cè)相應抗原的方法稱(chēng)熒光抗體法；用已知的熒光标記抗原示蹤或檢測(cè)相應抗體的方法稱(chēng)熒光抗原法。（熒光抗體方法較常用）
1.在開(kāi)始實驗研究前，有哪些因素需要考慮(lǜ)？
（1）根據抗原選擇合适的抗體，確(què)認抗原可以識别哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置。
（2）確(què)認目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)。
（3）根據所要研究的目标蛋白來確(què)定合适的樣本類型（石蠟切片、冰凍切片還是細胞制備(bèi)物等）。
（4）選擇抗體時需要考慮(lǜ)該(gāi)抗體的物種交叉反應。
（5）關於(yú)蛋白 ，需要考慮它的組織定位和細胞定位 ，以及染色時是否應該(gāi)有信号 。
（6）選(xuǎn)擇合适的固定方法及抗原修複(fù)方法。
（7）抗體的工作濃度或稀釋比例，以及抗體的物種來(lái)源也是需要考慮(lǜ)的重要因素。
2.免疫組化實驗裏爲什麽要對(duì)樣品進行處(chù)理？
樣品處理是爲瞭(le)調控樣本中蛋白的表達水平，如果是細胞實驗，就需要使用适當的抑制劑或激活劑來上調或下調細胞中某種蛋白質的表達；如果是體内實驗，就需要考慮更多的因素，因爲實驗對象是活的實驗動物，在選擇抑制劑或激活劑、激動劑或拮抗劑時，應盡量避免由於(yú)非特異性結合其它蛋白所導緻的非特異性效應。對於(yú)某些特殊試驗樣品，比如腦，我們需要確保細胞的滲透性，讓化合物能真正進入細胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學品能夠溶於(yú)合适的溶劑，還有確定适合的給藥途徑（注射或口服）。
3.請問如何根據(jù)具體的實驗對(duì)象來選擇不同的樣本形式呢？
對於(yú)細胞制備物，它們常見的形式是塗片或培養的細胞系。對於(yú)組織樣本，常用的是石蠟包埋的組織切片 ，福爾馬林固定。是因爲它們能夠保持組織形态與蛋白抗原性之間的zuijia平衡。石蠟包埋的組織切片很穩定，並(bìng)且易於(yú)使用 。但它的不足之處是很耗時（需要對切片進行脫蠟處理和抗原修複）。一般來說，石蠟切片适用於(yú)4微米厚的切片 。如果切片厚度大於(yú)4微米 ，抗體可能會被困住 ，導緻假陽性染色 ，這是我們需要避免的。
另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片，這對於(yú)不能經受醛固定處理和石蠟處理的抗原來說非常理想，因此這些抗原将呈現出更天然的狀态，但冰凍切片的缺點是組織形态可能不佳。冷凍切片通常僅适用於(yú)厚度爲4-10微米的薄切片，超過這個厚度的切片可能會困住抗原，導緻假陽性染色結果。如果要研究的組織類型無法做成這種厚度的薄切片，可以考慮採(cǎi)用漂片 。該技術一般用於(yú)腦組織和脊髓，在發育研究中，這是一項非常有用的技術，可用於(yú)厚度達 40 微米的更大切片。缺點是操作起來更加不便，整個過程中組織樣品都處於(yú)自由漂浮狀态，之後還必須将它們固定在載玻片上進行觀察，操作有一定的難度；另一個缺點就是非常耗時。
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