爲瞭(le)幫(bāng)助科研初學者快速上手，減少實驗摸索的苦惱，我們專門整理瞭(le)這篇幹貨 ，爲大家詳細介紹ELISA實驗流程和一些注意事項，一起來看看吧！
一 、ELISA操作前準(zhǔn)備(bèi)工作
試劑盒的選擇 ：ELISA操作前，應做好實驗的設計、選擇适合自己檢測(cè)範圍和靈敏度的試劑盒，如恒遠生物高敏ELISA，提前訂購和準備(bèi)試劑及耗材、處理樣本等準備(bèi)工作。
樣本處理：在收集标本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測(cè)的成份是否足夠穩定。ELISA檢測(cè)提倡新鮮标本盡早檢測(cè)，對收集後當天就進行檢測(cè)的标本，及時儲存在4℃備(bèi)用 ，如有特殊原因需要周期收集标本，請取材後，将标本及時分裝後放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解 ，直接影響實驗質量，所以避免反複凍融。
二 、ELISA标準(zhǔn)品溶解
标準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量标尺，因此标準品的溶解、倍比稀釋和保存要特别注意以下細節：凍幹标準品溶解按照說明書的要求，準確(què)複溶。在冰上操作标準品爲佳，靜止5-10分鍾 ，輕輕搖勻後按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。标準品嚴禁反複凍融。标準品的倍比稀釋應事先做好準備，如離心管的準備和編号以及稀釋液的準備;稀釋時，應充分混勻;採(cǎi)用進口或者矽化的EP管 ，減少蛋白吸附。在實驗孔内進行倍比稀釋時，注意操作規範，槍頭勿刮劃預包被的孔底。
三 、ELISA操作中的洗滌(dí)
洗滌(dí)是ELISA實驗中是多次數的操作，也是非常重要的步驟 。不嚴格的洗滌(dí)容易出現洗不幹淨或交叉污染現象，實驗重複(fù)效果差的現象。不管用多道加樣器 、洗瓶 、吸管 ，還是洗闆機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌(dí)的洗滌(dí)體積、洗滌(dí)時間和洗滌(dí)次數。注意标準化操作将減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。
a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特别是每次洗闆的前兩遍，若高濃度的孔污染瞭(le)低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì)增高。
b)特别注意：設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置，保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(從正上方旋轉120-150度)要迅速、幹脆。甩闆不要手腕左右搖擺(bǎi)、旋轉來甩液體!甩出後以直線方式補(bǔ)2-3次甩出液體。
c)用幹淨的濾紙 ，不要用衛生紙，因爲細小粉塵(chén)或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)緻洗闆不幹淨 ，結果偏高或偏低 ，重複孔的數值也會相差很大 。
d)每次拍闆不要重複在一個地方拍，特别是洗去酶的步驟;拍闆不宜過輕，否則拍不幹淨，拍闆很用力不會對(duì)蛋白有什麽影響 。但注意不要太重 ，以至把闆條給拍斷(duàn) 。每次洗闆後輕叩幾下 ，後一次一定要扣幹淨 。
e)不能減少洗液體積、洗闆時間和次數。洗闆時間太短，洗闆效果不佳 。延長(zhǎng)洗闆時間和增加洗闆次數可以使背景更幹(gàn)淨。
四、ELISA的标準(zhǔn)曲線(xiàn)如何拟合?
一般情況按照說明書推薦方法拟合标準曲線。标準曲線可以由酶标儀附帶軟件自動生成，也可手動制作。标準曲線呈“S"形曲線，兩端趨於(yú)水平，中間趨於(yú)線性，中間部分爲較佳的檢測範圍。當标準品的量超過與包被抗體結合的量，此時标準品已飽和，再增加标準品的量，其OD值不再變化，故當标準品達到一定濃度後，曲線就趨於(yú)水平。一般給出的濃度範圍落在中間線性範圍，根據标準曲線，可以測出樣本的濃度。按照科學分析方法，如果存在“奇異點"或者“污點"，直接採(cǎi)用線性分析不是很好，要對拟合标準曲線的幾個點進行取舍，同時也可改用雙對數直線拟合或者四因素曲線拟合。
今天的技術分享就到這裏瞭(le)，如果您有其他實驗問題可以關注“恒遠生物"微信公衆号或是聯系在線客服，爲您提供專業的技術指導(dǎo)。
點擊交流