Western blot(蛋白印迹)作爲科研研究中實驗其中一種方法，卻蘊含瞭(le)很多知識，可謂是小實驗裏卻有大文章 。針對WB實驗經常遇到的一些問題，上海恒遠生物技術專員總結出瞭(le)應對的一系列“5點(diǎn)”建議 ，希望您會喜歡！
更好的瞭解實驗的5點注意事項：
1.陽性對照對裂解物用來表明實驗室有效並且是正確的，及可證明目标蛋白不在樣本表達 。
2.跑在樣品旁邊的分子量标準能測定蛋白分子量的大小並且能監測電泳的進展。
3.避免手指直接接觸膜，應使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉膜效率並易産生背景污斑 。
4.確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同 ，邊緣太大會導緻在進行轉膜時電流不能通過膜。
5.過度曝光的膠片不适合用於分析，因爲不能判定相對蛋白量 。
更好的解決背景高的5點建議：
1.稀釋抗體至合适濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間。
2.抗體孵育溫度過高： 4℃孵育 。
3.膜幹燥：保證充分的反應液，避免出現幹膜現象。
4.封閉不充分： 延長封閉時間， 考慮更換合适的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未結合蛋白洗滌不充分： 增加洗滌次數。
更好的解決抗體問題的5點建議：
1. 一抗，二抗的比例比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。
2. 做細胞信号傳導 ，要做磷酸化某因子Western Blot，對二抗無要求，要看您實驗條件來選擇，一般推薦用HRP标記的二抗 。
3.不同抗體，即使是同一公司的抗體，其*的抗體稀釋度也是不一樣的，需要您實驗摸索 。
4. 如果您所用的抗體識别的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那麽這種抗體可同時用於免疫組化和Western，而如果抗體識别構象形表位 ，則隻能用於免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識别的氨基酸區間。（限於單抗）
5.抗體工作溶液一般不主張儲存反複使用，但是如抗體比較珍貴，可反複使用2－3次。稀釋後應在2－3天内使用，4度保存，避免反複凍融。
更好的解決無信号的5點建議 ：
1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔 ，二抗爲抗兔抗體）。原因 ： 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書，設置陽性對照。原因：一抗不識别檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低於20~30μg，設置陽性對照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉膜效果，檢測轉膜操作是否正確。PVDF膜預先浸在甲醇中 。原因 ：轉膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑，減少封閉時間 。原因：過度封閉使目标蛋白不能顯色。
更好的解決多條帶現象的5點建議 ：
1.查閱文獻。原因：體内表達的蛋白具有多種修飾形式 ，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因：蛋白樣本降解（蛋白質分子量降低）。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時間。原因：一抗濃度過高，高濃度時常出現多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平行對照試驗。原因： 細胞傳代次數過多，使其蛋白表達不同。
5.降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。原因：二抗濃度過高，高濃度産生非特異結合
更好的解決其他問題的5點建議 ：
1.轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點：抗體結合瞭封閉劑（過濾封閉劑）。
3.“微笑”條帶：遷移過快或電泳溫度過高，改變瞭pH值和遷移速度（降低遷移速度或低溫電泳）。
4.抗體量不足：確保在孵育時抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高：分離不*。
上海恒遠生物爲瞭(le)适應市場需要和長遠發展，近年來，引進相關技術專業人才和消化*的技術，不斷進行産品和技術的更新改進，同時完善的質量，提高企業的整體管理水平，保證體系，專業、規範 、是我們技術服務要求，科研實驗用品專業供應商之一，始終堅持；專注品質、信守承諾 、銳意進取，滿足於(yú)每一位老師的實驗要求，期待我們更美好的共赢發展！
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